专题详解Stereo-seq构建小鼠器官发育时空转录图谱2022年11月1日

　　前目，织直达录组原位表达信息的办法已有多种能够高通量地得到组，分辩率上存在较着的优势可是这些办法在单细胞，地区有限且捕捉，或一些发育中前期特定的构造仅能使用于小鼠晚期的胚胎，脑皮层如大，前期的小鼠胚胎中没法使用发育中，带来了宏大的应战这为研讨器官构成。

　　生严峻的功用成绩重生儿发育缺点产，发育前期闪现其影响经常在。特别是发育缺点相干疾病的才能和共同劣势为探究MOSTA在剖析哺乳植物遗传疾病，type-to-Phenotype database）数据库搜集了与诞生缺点相干的基因研讨职员在DDG2P（The Developmental Disorders Geno，、肺、结缔构造、骨骼和肌肉8个构造器官的表达状况（图6A）并阐发它们在MOSTA中对8个工夫点中大脑、脊髓、心脏、肝脏，具有连锁效应发明很多基因，多个器官表达且可同时在。如例，合征的NKX2-1基因招致脑-肺-甲状腺综，下构造和肺中表达（图6B）次要在大脑中的海马体和皮层；e）的WNT5A表达于脸部、四肢、生殖嵴和大脑中招致雷宾诺综合征（Robinow Syndrom，型相分歧与疾病表。

　　胞程度上在单细，间转录组阐发对胚胎停止空，胞运气的静态变革相当主要对理解构造发育过程当中的细。6.5的小鼠胚胎研讨职员对E1，像的单细胞朋分停止了基于影，细胞停止过滤以后将捕捉率较低的，281得到了,个细胞377，细胞有1均匀每一个,和529个基因107个UMI。类并UMAP可视化后对细胞停止无监视聚，细胞范例（图5A）获得了25种次要的，光滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞等包罗放射状胶质细胞、上皮细胞、。

　　时同，seq对构造功用地区审定的才能研讨职员也评价了Stereo-。50DNB bins对bin50（50×，）的数据25µm，onstrained clustering）聚类办法操纵自立开辟的非监视的SCC（spatially-c，类阐发停止聚，个大脑功用区审定到共20，层的差别分层包罗大脑皮，构及其亚构造（图2C）海马、丘脑、纹状体等结。

　　成骨细胞进一步分类落后一步对上皮细胞和，更多的细胞亚形发明可以审定到。a2+、S100a6+）、肺纤毛细胞（DynIrb2+、Foxj1+）、胸腺上皮细胞（Tcrg-C1+、Tbata+）等（图5B）上皮细胞可细分为毛囊细胞（Krt5+、Krt17+）、肺泡II型细胞（Foxp2+、Nkx2-1+）、支气管外排泄细胞（Scgb3。进一步分群后对成骨细胞的，逐步构成和成熟历程发明可以审定到其，x1+、FbxI7+）、晚期肥大成骨细胞（Runx2+、Ibsp+）、晚期肥大成骨细胞（Spp1+、Mmp9+）包罗圆构成骨细胞（Sox5+、Sox9+）、柱状成骨细胞（Sulf1+、Robo1+）、前肥大成骨细胞（Prr，、Fmod+）（图5C）和髓核细胞（Pax1+。

　　回背侧中脑构造落后一步空间映照，胚胎工夫点中发如今差别，细胞分化而来的NeuB祖细胞（RGC）和祖，异质性（图6B、图6C）GlioB存在空间散布。的小鼠胚胎中在E12.5，含量最多RGC的，背侧中脑中普遍散布在，B稠密散布在背侧中脑而这个阶段的Neu，在背侧中脑的中段和尾侧而GlioB则较集平分布。的小鼠胚胎中在E14.5，的RGC已消逝背侧中脑前端，区的尾侧地区只存在于脑室，各自富集在特定的区块NeuB和GiloB，织退路程序化功用差别分化表白沿着脑室区单位的组，的细胞范例发生了差别。6.5中在 E1，少并集合在尾端RGC进一步减，散布愈加受限NeuB的，原始地位的数目增长而GlioB则在。现表白这些发，质发作差别步神经发作和胶，具偶然空不合错误称性RGC的分化历程。序阐发（利用monocle 3）对这三个阶段的祖细胞停止空间拟时，（图6D~图6F）也证明了这些成果。

　　片和原位mRNA捕捉手艺分离DNA 纳米球阵列芯，转录组测序手艺Stereo-seq成立了具有高分辩率和大视场的时空。eo-seq手艺并操纵Ster，间点的小鼠胚胎器官发育时空转录组图谱构建了从E9.5到E16.5共8个时。

　　上综，能够基于影象停止细胞朋分Stereo-seq既，空间组转录组数据获得单细胞程度的，ning的方法也可经由过程bin，差别功用地区辨认构造中的。

　　广州生物医药与安康研讨院、MIT（麻省理工学院）次要研讨团队：深圳华大性命科学研讨院、中国科学院等

　　安康研讨院、MIT（麻省理工学院）等多个科研团队配合完本钱研讨由深圳华大性命科学研讨院、中国科学院广州生物医药与。赖毅维和邱肖杰为该论文的配合第一作者陈奥、廖莎、成梦南、麻凯龙、吴亮、， A. Esteban为论文的配合通信作者汪建、徐讯、刘龙奇、黎宇翔和Miguel。过伦理检查本研讨已通，法例和伦理原则严厉遵照响应。

　　分析胚胎发育的枢纽空间原位表达信息是。、单细胞分辩率、高活络度和大视野等特征Stereo-seq具有全转录组笼盖，q推行使用到更多的使用处景有益于将Stereo-se，、癌症等研讨范畴如研讨灵长类发育。来未，核苷酸标识表记标帜的抗体同时检测细胞外表标记深圳华大性命科学研讨院团队还将操纵寡，阐发得到表观遗传信息或整合染色质开放组。究范畴的使用除开展研，推行使用到更多生物医学范畴Stereo-seq也将被，学数据的手腕进入通例临床理论如作为弥补医学成像和构造病理。

　　主要的感官调控功用中脑具有许多十分，动和温度调理等如视觉、听力、运。构上结，上丘和下丘的层级构造背侧中脑还存在构成。其他功用地区相较于大脑的，质性和细胞空间组成发育中的中脑细胞异，统地研讨鲜有被系。的小鼠胚胎中脑空间转录组数据停止单细胞朋分、聚类研讨职员对E12.5、E14.5和E16.5，adial glia cells审定到了包罗放射状胶质细胞（r，neuroblastsRGC）、神经母细胞（，胞（glioblastNeuB）、胶质母细， (GABAergic neuronGlioB）、γ-氨基丁酸能神经元，lutamatergic neuronGABA Neu)、谷氨酸能神经元（g，细胞（microglialGlu Neu）、小胶质，种细胞范例（图6A）Micro）等11。

　　seq芯片（Stereo chip）用于mRNA原位捕捉的Stereo-，测序手艺不异的芯片加工工艺利用了与华大DNBSEQ，性点（Spot）具有划定规矩布列的活，直径约为220nm每一个Spot点的，点的间隔为500nm两个Spot点的中间。一段随机分解的25nt序列作为空间坐标（coordinate identityStereo chip的制备历程和Stereo-seq手艺道理以下：起首操纵，D）CI，随机分解序列包罗25nt，扩增复制颠末滚环，NA nanoball构成DNA纳米球（D，B）DN。tereo chip上DNB随后被分离到S，划定规矩布列的Spot上并落入芯片中数十亿。的DNB停止测序（第一轮测序）经由过程DNBSEQ测序仪对芯片上，序列及对应的空间坐标获得25nt的CID。份子和捕捉探针（Oligo-dT）毗连然后经由过程生化分解将CID序列与UMI，获芯片（图1A构建成完好的捕，步调3）步调1到。后随，在Stereo-seq捕捉芯片的外表将10µm厚度的冷冻包埋构造切片贴敷，牢固和透化颠末构造，的mRNA开释构造中， chip原位捕捉并被Stereo。分解带有CID序列的cDNA被捕捉的mRNA颠末逆转录，高通量测序（第二轮测序）再停止扩增、文库构建和，A份子在Stereo chip中的物理地位测序数据阐发中可经由过程CID序列复原mRN，织原位表达信息（图 1A进而对应得到高分辩率的组，步调6）步调4到。

　　芯片和原位mRNA捕捉手艺本研讨基于DNA纳米球阵列，4.24cm2）、最活络的基因捕捉（1成立了具有迄今最大捕捉面积（最大17,率（500nm）的Stereo-seq手艺450个UMI/100μm2）和单细胞分辩，中晚期器官发作的基因空间表达形式并使用该手艺剖析了小鼠胚胎发育，发育的轨迹图绘制了器官，育时空转录组图谱构建了小鼠器官发。

　　科学研讨院主导深圳华大性命，外多个单元结合海内，术Stereo-seq操纵华大自立时空组学技，的转录组表达的时空静态变革剖析了在小鼠胚胎发育过程当中。深化探求哺乳植物发育的机制该小鼠胚胎发育图谱将有助于。月4日揭晓于Cell该功效于2022年5，者吴亮博士的具体解读以下是文章配合第一作。

　　空间转录组学测序手艺相较于今朝已报导的，最高的分辩率（500nm）Stereo-seq具有，中利用的最大的芯片为200mm2同时具有最大的捕捉面积（此研讨，chip最大面积做到174.24cm2完好的可用于原位捕捉的Stereo ；B）图1。且而，的精度下在不异，活络的mRNA捕捉才能（图1C）Stereo-seq具有更强和更。

　　是怎样跟着工夫和空间的变革了解一个万能性干细胞受精卵，成一个庞大的生物体以准确的调控发育形，迷的科学应战之一不断是最使人着。年来近，序手艺的开展单细胞组学测，的基因表达和调控有了十分细致的形貌研讨职员对小鼠胚胎发育历程的静态。手艺限定但因为，程中细胞的地位和功用停止探究研讨职员其实不克不及精确地对发育过。此因，空间转录组手艺开展高精度的，物发育中庞大性的枢纽将是进一步剖析哺乳动。

　　上颌地区和肢体地区的数据研讨职员提取小鼠胚胎的，无监视聚类、审定细胞范例进一步停止单细胞朋分和，构造中的间质细胞和成纤维细胞发明WNT5A高表达于上颌，细胞中（图7C 、图7D）而在肢体中则高表达于间质，和肢体的致病机制能够差别表白雷宾诺综合征在上颌。阐发发明进一步，骨的多种细胞范例（包罗间充质细胞）中表达WNT5A的下流调控因子MSX1在上颌，于间充质细胞中但在肢体中仅限。样同，胞和肢体的间充质细胞中更高（图7C、图7D）MSX1调控活性在上颌骨的间充质细胞和成纤维细。征疾病表型潜伏份子发活力制以上成果提醒了雷宾诺综合。

　　anogenesis spatiotemporal transcriptomic atlas研讨职员操纵Stereo-seq手艺成立了小鼠器官发作的时空转录组图谱(mouse org,STAMO；），究使用潜力展现了其研。53个矢状切片该图谱包罗了，胎发育过程当中剖析了小鼠胚，.5间共8个工夫点从E9.5到E16，录组时空静态变革全胚胎范畴的转。E16.5胚胎的差别切面此中13个切片来自统一个，三维空间转录组图谱（图3）构建了胚胎发育靠近终末期的。

　　6J雌性小鼠的嗅球和大脑来自12周的C57BL/；5天（E16.5）共8个工夫点的小鼠胚胎发育至第9.5天（E9.5）至第16.。

　　切面的胚胎停止聚类阐发经由过程SCC算法对每一个，婚配的次要构造和器官审定了与每一个工夫点相，及其构造特同性的表达信息（图3）比方皮肤、骨骼、肌肉、心脏、肺等。genesis）阐发算法对差别工夫点的胚胎的功用器官地区构建了发育轨迹图（图4）并操纵TOME（trajectories of mammalian embryo。

　　构造中细胞组成的空间异质性的剖析才能为了进一步评价Stereo-seq对，鼠的大脑半脑冠状切面的空间表达图谱阐发研讨研讨职员将Stereo-seq使用于成年小。行透化前在构造进，停止染色记载操纵核酸染料，间转录组地位信息停止比照（图2A）并与Stereo-seq产出的空，地位信息高度堆叠显现二者的空间，q完成了精确的原位捕捉表白Stereo-se。后随，色的细胞定位基于核酸染，cell segmentation）（图2A、图2B）对Stereo-seq转录数据停止了单细胞朋分阐发（，细胞类群/亚类审定到27个，（excitatory neuron包罗来自差别地区的8类镇静神经元亚类，经元亚类（inhibitory neuronEX）、4类表达差别神经化学因子的抑止性神，状胶质细胞亚类（astrocyteIN）和5类具有差别地区散布的放射，2C、图2D）等Astr）（图。

　　分析胚胎发育的枢纽空间原位表达信息是。、单细胞分辩率、高活络度和大视野等特征Stereo-seq具有全转录组笼盖，q推行使用到更多的使用处景有益于将Stereo-se，、癌症等研讨范畴如研讨灵长类发育。